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ZCIBIO免疫熒光檢測

發(fā)布時間: 2023-11-10  點擊次數(shù): 317次

免疫熒光(IF),是應用抗原與抗體特異性結合的原理,通過熒光標記抗體對組織細胞內(nèi)抗原進行定位、定性及定量的研究。目前科沿有道主要可以對石蠟切片、冰凍切片、細胞爬片、組織芯片進行免疫熒光檢測。科沿有道目前已突破傳統(tǒng)的免疫熒光雙標限制,開發(fā)出多色免疫熒光技術




實驗流程:

冰凍切片免疫熒光實驗步驟

1、 冰凍切片固定:冰凍切片從冰箱拿出來復溫,晾干水分,冷丙酮固定10min,待丙酮干后于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min

2、 抗原修復:組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH8.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。中低火5min,此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。(修復液和修復強度根據(jù)組織來確定)

3、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min

4、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

5、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min

6、 DAPI復染細胞核:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min

7、 封片:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nmFITC綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nmCY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm

石蠟切片免疫熒光實驗步驟

1、 石蠟切片脫蠟至水:依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸餾水洗。

2、 抗原修復:組織切片置于盛滿EDTA抗原修復緩沖液(PH9.0)的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復。中火至沸后斷電間隔10min中低火至沸,此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā),切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min(修復液和修復條件根據(jù)組織來確定)

3、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走),在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織,室溫封閉30min

4、 加一抗:輕輕甩掉封閉液,在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗,切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))

5、 加二抗:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的二抗覆蓋組織,避光室溫孵育50min

6、 DAPI復染細胞核:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,避光室溫孵育10min

7、 封片:玻片置于PBSPH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次,每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

8、 鏡檢拍照:切片于尼康倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。(紫外激發(fā)波長330-380nm,發(fā)射波長420nmFITC綠光激發(fā)波長465-495nm,發(fā)射波長515-555 nmCY3紅光激發(fā)波長510-560,發(fā)射波長590nm



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